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                  出血性大腸埃希氏菌

                  • 更新時間:  2018-05-14
                  • 產品型號:  
                  • 簡單描述
                  • 公司主營各種系列細胞株、不同種屬細胞株,細胞株庫存種類齊全,*可滿足廣大客戶的細胞研究實驗需求,公司細胞株活性強、生長特性正常,實驗效果好,良好的售后服務,長期得到國內外顧客的厚愛,我們的出血性大腸埃希氏菌,價格公道、實惠。
                  詳細介紹

                  出血性大腸埃希氏菌復蘇步驟注意事項:

                        【材料】
                  1.  常規細胞培養儀器設備 恒溫水浴振蕩器。
                  2.  培養液(DMEM)胎牛血清(CBS)二甲基亞砜(DMSO)
                  【操作程序】
                  1.  細胞實驗室進行常規消毒,紫外照射40min以上。
                  2.  培養液(DMEM)、0.25%胰蛋白酶(Trypsin)恒溫水浴箱370C預熱20min,備用。
                  3.  二甲基亞砜(DMSO)在40C冰箱中冷藏30min,備用。
                  4.  從液氮保存罐中取出凍存管,立即放入400C水浴中,快速搖晃,直至凍存液*融化。
                  5.  將細胞懸液移入15ml離心管,緩慢加入4ml培養液,離心(1000r/min,5min)。
                  6.  用培養液懸液混懸沉淀細胞,調整細胞濃度,方培養箱中培養。
                  7.  記錄復蘇日期。
                  出血性大腸埃希氏菌 常問題及解決方案
                      細胞漂?。号囵B瓶不開封,瓶口酒精擦拭后平躺放置在培養箱。次日觀察,如細胞大部分又貼回瓶底,表明細胞活力正常,剩余漂浮的細胞可以離心去掉,留10ml培養液培養觀察,細胞生長至匯合度80%,進行消化傳代;如細胞還是不貼壁,將細胞離心收集轉到新培養瓶,原培養瓶加部分培養液繼續培養,中間注意觀察,我們的技術人員會一直跟蹤技術指導,直到問題解決。

                     客戶收到細胞后請務必仔細閱讀細胞注意事項,確保細胞的培養條件*,如果由于培養條件不*導  致細胞出現問題,責任由客戶自行承擔。由于運輸的情況,所以個別細胞會出現不穩定,客戶收到細胞后務必*時間和我們,告知細胞具體情況,以便我們技術人員能及時有效的和老師溝通,不勝感謝!

                  【注意事項】
                  1.  取細胞的過程中注意帶好防凍手套,護目鏡。此項尤為重要,細胞凍存管可能漏入液氮,解凍時凍存管中的氣溫急劇上升,可導致爆炸。
                  2.  凍存液的問題:凍存液的配置已是常識,在這里不作詳述,但二甲基亞砜(DMSO)對細胞不是*無毒副作用,在常溫下,二甲基亞砜對細胞的毒副作 較大,因此,必須在1-2min內使凍存液*融化。如果復蘇溫度太慢,會造成細胞的損傷,二甲基亞砜(DMSO)選擇進口產品。
                  3.  離心前須加入少量培養液。細胞解凍后二甲基亞砜濃度較高,注意加入少量培養液可稀釋其濃度,以減少對細胞的損傷。
                  4.  離心問題:目前主要有兩種見解。一種是解凍后的細胞懸液直接吹打均勻后分裝到培養瓶中進行培養,第二天換液。因為離心的目的是兩個,去除 DMSO,去除死細胞,這個是標準流程,但對一般人來說,把握不好離心轉速和時間,轉的不夠活細胞沉底的少,細胞就全被扔掉了,轉過了活細胞會受壓過大, 死亡。此外在操作過程中容易污染,所以不推薦。另一種說法為細胞懸液中含有二甲基亞砜(DMSO),DMSO對細胞有一定的毒副作用,所以須將離心后的液 體前倒凈,且一定倒干凈。我在試驗中按照常規的離心分裝的方法進行復蘇,結果無有異常。
                  5.  細胞貼壁少的問題:教科書中說明凍存細胞解凍時1ml細胞液要加10ml-15m培養液,而在我的試驗中的經驗總結為培養基越少細胞越容易貼附。
                  6.  復蘇細胞分裝的問題:試驗中我的經驗總結為復蘇1管細胞一般可分裝到1-2只培養瓶中,分裝過多,細胞濃度過低,不利于細胞的貼壁。
                  7.  加培養基的量放入問題:這個量的多少的把握主要涉及到的問題是DMSO的濃度,從如果你加培養基的太少,那么DMSO的濃度就會比較大,就會影響 細胞生長,從以前的資料來看,DMSO的濃度在小于0.5%的時候對一般細胞沒有什么影響,還有一個說法是1%。所以如果你的凍存液的濃度是 10%DMSO的話那么加10ml以上的培養基就恰好稀釋到了無害濃度。

                   

                  一、原理
                  在不加任何條件下直接凍存細胞時,細胞內和外環境中的水都會形成冰晶,能導致細胞內發生機械損傷、電解質升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等,能引起細胞死亡。如向培養液加入保護劑,可使冰點降低。在緩慢的凍結條件下,能使細胞內水份在凍結前透出細胞。貯存在-130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。
                  細胞復蘇時速度要快,使之迅速通過細胞zui易受損的-5~0℃,細胞仍能生長,活力受損不大
                  目前常用的保護劑為二甲亞砜(DMSO)和甘油,它們對細胞無毒性,分子量小,溶解度大,易穿透細胞。
                  二、操作步驟
                  (一)凍存
                  1、消化細胞(同實驗二),將細胞懸液收集至離心管中。
                  2、1000rpm離心10分鐘,棄上清液。
                  3、沉淀加含保護液的培養,計數,調整至5×106/ml左右。
                  4、將懸液分至凍存管中,每管1 ml。
                  5、將凍存管口封嚴。如用安瓿瓶則火焰封口,封口一定要嚴,否則復蘇時易出現爆裂。
                  6、貼上標簽,寫明細胞種類,凍存日期。凍存管外拴一金屬重物和一細繩。
                  7、按下列順序降溫:室溫→4℃(20分鐘〕→冰箱冷凍室(30分鐘)→低溫冰箱(-30℃ 1小時)→氣態氮(30分鐘)→液氮。
                  注意:操作時應小心,以免液氮凍傷。液氮定期檢查,隨時補充,不能揮發干凈,一般30立升的液氮能用1~1.5月。
                  (二)復蘇
                  1、準備一個茶缸或1000ml的燒壞,內裝2/3杯37℃的溫水。
                  2、從液氮中取出凍存管、迅速置于溫水中并不斷攪動。使凍存管中的凍存物在1分鐘之內融化。
                  3、打開凍存管,將細胞懸液吸到離心管中。
                  4、1000rpm離心10分鐘,棄去上清液。
                  5、沉淀加10ml培養液,吹打均勻,再離心10分鐘,棄上清液。
                  6、加適當培養基后將細胞轉移至培養瓶中,37℃培養,第二天觀察生長情況。
                  三、    
                  試劑和器材

                  器材:液氮罐、凍存管(塑料螺口凍存管或安瓿瓶)、離心管、吸管、離心機等
                  試劑:0.25%胰酶、培養基、含保護劑的培養基(即凍存液)
                  附:凍存液配制:
                  培養基加入甘油或DSMO,使其終濃度達5—20%。保護劑的種類和用量視不同細胞而不同。配好后4℃下保存。


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