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                  ELISA檢測過程三項對照和用途論述
                  瀏覽次數:670發布日期:2023-11-20

                     ELISA檢測,按照試劑說明書要求,每次試驗、每塊扳上都要設置以下3項對照和用途:  
                  1.空白對照:

                  僅用稀釋液代替檢測樣本、用以觀測最終反應的顯色“本底"、并用于酶標儀消除、扣除“本底",即:以本底為“零"讀取陽性、陰性對照孔和樣本檢測孔的吸光值(A);或者,在計算陰性對照均值(NCx)、陽性對照均值(PCx)、樣本讀數的S/C.O.值時減去空白對照的本底吸光值。早年的酶標儀無自動扣除空白對照孔讀數功能,這種酶標議現已淘汰不用了,寫上這段話的意思是補充說明設置空白對照的用途??瞻卓拙唧w如何讀取讀數,則依照說明書操作。例如,生物梅里埃中國有限公司的中文版《人類免疫缺陷病毒抗原抗體診斷試劑盒(酶聯免疫法)使用說明書》上提示:以空氣讀空白(不放板架和板條),在450nm(單波長)、或450nm和620—700mn(底物是TMB)參考波長進行讀數。
                  2.陰性對照(品):
                  (1)、陰性對照(品)的概念與要求:

                  所謂陰性對照(品),應當是本項檢測試驗中采用與待撿物(樣品、人用試劑就是人的血清等)具有同源性和同質性,又不含有待檢物質,并能客觀比較和鑒別處理因素(血清免疫學試驗中有特異性抗原與抗體反應)之間的差異。因此,用動物血清或其制品(如牛血清白蛋白等)代替陰性人血清作為對照品,從理論和實踐上都是不可取的,弊端甚多,無須細述。注意:據我所知,國產ELISA試劑中,有的廠牌是用動物血清制品稀釋配置、或與部分人血清混合配置的;其二,陰性對照讀數,并非是“越低越好"。NCx值接近0.00X水平,這是假象!試想一下,真正采用“陰性人血清"的陰性對照品,NCx值會如此之低嗎?舉個例子,雅培乙肝六項EIA試劑的NCx值,分別為:0.010(HBsAg)、0.027(抗—HBs)、0.035(HBeAg)、1.083(抗—HBe)、1.065(抗—HBc)、0.045(抗HBc-IgM)。生物梅里埃的HIV試劑NCx是0.091。辨別試劑NCx值是否合理的一個很簡單的方法,只要對比大量陰性樣本的實際讀數就“一目了然"啦!
                  一個題外插曲:表明ELISA試劑內在質量的一個重要統計標志,就是要看:陰性樣本的的上限不應當大于、必須小于C.O.I.=1.00;反之,陽性樣本的的下限不可小于、應當大于C.O.I.=1.00!早年我用SPSS軟件輸出阿克蘇HIV和國產甲、乙試劑檢測600例左右的健康人體檢血清的三幅直方圖,可以表明陰性樣本的不同分布特征,頗有意思。  
                  我為什么要如此細說NCx呢?因為NCx值在Cut off值計算中是相當舉足輕重的(詳后)。

                  (2)、陰性對照(品)分為兩類
                  一是代表受檢人血清中并不含有、或方法學靈敏度未能檢出的待檢物的基準水平,并且是結果判斷值(Cut off)計算式中決定“是"(陽性)、或“否"(陰性)的唯 1可變值。陰性對照值高,導致假陰性;反之,導致假陽性。如:HBsAg、HBeAg、抗—HBc等。二是陰性對照設置,在方法學上要求加入指示性定量標準品,如中和劑HBeAg,定量HBcAg等,用以檢測抗—HBe、抗—HBc?;蛘?,選取代表平均水平的正常人血清用作陰性對照,如檢測抗—HBc IgM。此類Cut off 值計算時,多數均包括陰性和陽性對照值2個可變值。

                  3.陽性對照(品):
                  (1)、陽性對照(品)的概念與要求:

                  同陰性對照(品),只是采用“精選"的含有待檢物質的人血清制備而成。所謂“精選",就是把收集的陽性人血清經過數種試驗進行“篩試"、把含有“干擾性物質"的血清剔除、不用,以避免出現“假陽性"干擾試驗結果。  
                  (2)、陽性對照(品)設置,也可區分為兩種類型與用途:
                  一是陽性對照主要用于評價該項試驗結果是否有效和試驗結果的穩定性與可比性。而所設的陽性對照的測量值不列入Cut off值計算、但是不可不做。如HBsAg、抗—HBs、HBeAg等。
                  二是陽性對照的設置,不僅用于評價試驗結果是否有效和試驗結果的穩定性與可比性,而且計入Cut off的計算。此時的Cut off值的含義是代表該標志物在健康(正常)人群中正常值范圍的上限。待檢樣本檢測值超過該上限(Cut off)時表示有診斷意義。例如抗—HBe、抗—HBc、抗—HBc IgM等。



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